L'étape centrale de désinfection est commune à tous les traitements, et c'est la plus importante. Elle a pour but de neutraliser tous les virus et bactéries pathogènes. Pour les eaux souterraines naturellement plus pures, la désinfection prévient le risque d'une éventuelle contamination par infiltration.

Elle peut être effectuée par des agents chlorés (chlore gazeux, eau de Javel, bioxyde de chlore), par l'ozone, par l'utilisation d'ultraviolets ou par des procédés physiques comme la filtration sur membranes.
Le chlore est le plus utilisé, à la fois pour son prix de revient, pour sa simplicité de mise en œuvre, et son efficacité.

Le bioxyde de chlore est beaucoup moins utilisé. Il est plus onéreux et d'une mise en œuvre plus complexe. Il est choisi dans certains cas pour éviter de donner à l'eau un goût désagréable.

L'ozone est un oxydant puissant. Sa molécule est formée de trois atomes d'oxygène. A forte dose, l'ozone a une action bactéricide et virulicide. Il est inodore. Il a la propriété de rendre biodégradable une partie de la matière organique. Par rapport à la désinfection par le chlore, l'ozonation présente l'avantage d'améliorer la qualité gustative de l'eau. Fabriqué industriellement, l'ozone est coûteux, et sa mise en œuvre est relativement complexe. De plus, l'ozone n'a pas de pouvoir rémanent.

Pour que la désinfection soit totalement efficace, il convient que la clarification ait opéré une élimination parfaite des matières organiques, des métaux, etc.